Resolução de lípidos em células vivas: um novo avanço na microscopia fotoacústica infravermelha média hiperespectral

Os lípidos não são apenas componentes estruturais das membranas celulares e moléculas de armazenamento de energia, mas também estão estreitamente relacionados com a ocorrência e desenvolvimento de câncer, obesidade, diabetes,doenças cardiovascularesNo entanto, a observação direta e a distinção dos diferentes tipos de lipídios nas células vivas enfrentam há muito tempo desafios técnicos.Os métodos tradicionais de rotulagem fluorescente são limitados pela eficiência da rotulagem, especificidade e potencial interferência com as funções celulares, enquanto as técnicas ópticas sem rótulo muitas vezes lutam para distinguir moléculas de lipídios com estruturas químicas semelhantes.

A Nature Methods publicou um estudo que introduz uma tecnologia chamada "Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy Hyperspectral" (hyFOPM).Utilizando os modos de vibração de ligação única na região da impressão digital infravermelha média, esta tecnologia permite a detecção sem rótulo e imagem dinâmica de esfingomielina (SM) e colesterol (Chol) em células vivas.

Princípios técnicos
A maioria dos métodos ópticos sem rótulo baseia-se em sinais na região de vibração de alongamento C-H (aproximadamente 2800-3000 cm−1), mas as bandas espectrais nesta região são muito semelhantes em vários lípidos,dificultando a distinção entre os diferentes tiposEm contraste, a região da impressão digital infravermelha média (900 ̊1730 cm−1) contém mais informações de vibração de ligação única que refletem a estrutura única das moléculas,como a absorção característica das ligações amidas, ligações de éster e anéis de esteróides.

O projeto do sistema hyFOPM centra-se neste conceito. Ele emprega um laser de cascata quântica sintonizável como fonte de excitação, cobrindo a faixa de 900 2932 cm−1 com uma resolução espectral de 2 cm−1.Pulsos de laser excitam a amostra para gerar sinais fotoacústicosO sistema tem uma resolução espacial de aproximadamente 4,3 μm, permitindo a obtenção de imagens a nível de células vivas.

Validação dos modelos lipídicos
Para verificar a viabilidade da tecnologia, a equipa de investigação preparou primeiro modelos bidimensionais de solução lipídica contendo colesterol (Chol), fosfatidilcolina insaturada (DOPC),e esfingomielina (SM).

(1)Comparação das características espectrais

Os espectros da região da impressão digital coletados pelo hyFOPM são altamente consistentes com os resultados do ATR-FTIR.O colesterol apresenta um forte pico de absorção para a deformação do anel de esteróides a 1056 cm−1; DOPC apresenta C = O vibração de alongamento do grupo éster em 1731 cm−1; e esfingomielina corresponde à banda amida I, banda amida II, e ácido graxo CH2 vibração de curvatura em 1645 cm−1,1555 cm−1, e 1464 cm−1, respectivamente.

(2)Capacidade de desmistura e classificação espectral
Quando se utilizam apenas 15 números de onda na região da impressão digital para a desmistura linear, o cruzamento entre colesterol e esfingomielina é próximo de 0%, enquanto o cruzamento para DOPC é de 23%.o crosstalk aumenta significativamente ao usar 7 números de onda na região de alongamento C-HAplicação posterior da análise discriminante linear (LDA) mostra que a precisão média de classificação atinge 96% quando se utiliza a região da impressão digital ou a região C-H,e atinge 97% quando se utilizam todos os números de onda.

(3) Modelos de Vesícula Unilamellar Gigante (GUV)
O estudo preparou três tipos de GUVs para simular membranas celulares: Modelo 1, uma mistura 1:1 de SM e Chol, formando uma membrana densamente ordenada; Modelo 2, um 2:21 mistura de DOPC, SM e Chol, coexistindo em fases ordenadas em líquido e desordenadas em líquido; e Modelo 3, DOPC puro, formando uma membrana fluida desordenada.As imagens obtidas pelo hyFOPM a 2852 cm-1 são morfologicamente consistentes com as obtidas pela coloração fluorescente vermelho do NiloAs características espectrais de diferentes vesículas correspondem a lípidos puros, confirmando que os componentes individuais em membranas mistas podem ser identificados.

(4) Aplicações de controlo de qualidade
Ao realizar medições espectrais em 10 GUVs diferentes para cada tipo e traçar diagramas de fase ternaros,A equipa de investigação descobriu que a composição lipídica real desviou- se da razão- alvo (uma discrepância de aproximadamente 40%)Isto indica que o hyFOPM pode ser utilizado para avaliação da qualidade na preparação de GUV.

Aplicações nas células vivas
O estudo aplicou ainda o hyFOPM a células vivas, observando as mudanças dinâmicas da esfingomielina e do colesterol em dois modelos celulares, respectivamente.

(1)Acumulação de esfingomielina nas células A549
As células de adenocarcinoma pulmonar humano (A549) foram tratadas com o composto antitumoral ácido 2- hidroxioleico (2- OHOA), que deverá induzir a acumulação de esfingomielina.Os espectros da região das impressões digitais (1600-1400 cm−1) foram recolhidos de 50 células., mostrando que a área máxima de 1464 cm-1 aumentou 117% após o tratamento, em comparação com apenas 23% no grupo de controlo no mesmo período.A imagem foi realizada em 3000 células usando apenas quatro números de onda (2852 cm−1 para lípidos totais)Os resultados mostraram que o sinal de esfingomielina continuou a aumentar 48 e 72 horas após o tratamento.enquanto o sinal de colesterol não mostrou alteração significativa.

(2) Carga de colesterol nas células HEK
As células renais embrionárias humanas (HEK293) foram co- incubadas com um complexo metil- β- ciclodextrina- colesterol (MβCD- Chol) para aumentar o colesterol na membrana celular.Os espectros da região da impressão digital de 50 células mostraram que a área do pico de 1048 cm−1 aumentou 161% após o tratamento., enquanto o pico de 1464 cm-1 para esfingomielina diminuiu ligeiramente, em conformidade com a propriedade conhecida de que a ciclodextrina extrai alguns lipídios da membrana ao fornecer colesterol.A imagem de múltiplas ondas de 3000 células confirmou ainda mais a elevação do sinal de colesterol, com um ligeiro aumento do sinal lipídico total e pouca alteração no sinal proteico.

Significado e Perspectivas
Este estudo demonstra a capacidade de distinguir moléculas lipídicas com estruturas químicas semelhantes em células vivas sem rotulagem.Em comparação com os métodos tradicionais baseados na rotulagem fluorescente ou isotópica, o hyFOPM evita questões como a eficiência da rotulagem e a interferência com as funções celulares,e a sua seletividade pode ser adaptada de forma flexível às características espectrais dos lipídios alvo ajustando os números de onda de excitação.

A especificidade espectral do sistema actual na região da impressão digital é superior à da região de alongamento C-H, o que abre possibilidades para distinguir mais subtipos lipídicos.O estudo salienta igualmente que a combinação de técnicas avançadas de desmisturaAlém disso, a microscopia fotoacústica infravermelha média pode atingir uma profundidade de imagem superior a 150 μm no tecido,e futuras aplicações podem ser estendidas a amostras grossas ou a ambientes in vivoA aceleração tecnológica (por exemplo,A subamostragem espectral) e a miniaturização do sistema são direções importantes para avançar esta tecnologia em direção à análise do ponto de atendimento ou testes de laboratório de rotina.